स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के अनुप्रयोग का सामान्य ज्ञान क्या है?

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आधुनिक आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में नियमित साधन बन गए हैं। अक्सर न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन की मात्रा और जीवाणु वृद्धि सांद्रता की मात्रा का ठहराव के लिए उपयोग किया जाता है।

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का सरल सिद्धांत

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर एक प्रकाश स्रोत का उपयोग करता है जो कई तरंग दैर्ध्य उत्पन्न कर सकता है, और एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य के प्रकाश स्रोत को उत्पन्न करने के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपिक उपकरणों की एक श्रृंखला से गुजरता है। प्रकाश स्रोत के परीक्षण के लिए नमूने के माध्यम से गुजरने के बाद, प्रकाश स्रोत का हिस्सा अवशोषित होता है, और नमूने के अवशोषण की गणना की जाती है, जिससे नमूना एकाग्रता में परिवर्तित हो जाता है। । नमूने का अवशोषण नमूना की एकाग्रता के समानुपाती होता है।

न्यूक्लिक एसिड की मात्रा

न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का सबसे अक्सर इस्तेमाल किया जाने वाला कार्य है। ओलीगोन्यूक्लियोटाइड्स, एकल-फंसे हुए, डबल-फंसे हुए डीएनए, और आरएनए को एक बफर में मात्राबद्ध किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड के उच्चतम अवशोषण शिखर का अवशोषण शिखर 260 एनएम है। प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड की आणविक संरचना अलग होती है, इसलिए रूपांतरण कारक भिन्न होते हैं। विभिन्न प्रकार के न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पहले से संबंधित गुणांक का चयन करें। उदाहरण के लिए, 1 OD का अवशोषण dsDNA के 50 μg / ml, 37 μg / ssDNA के एमएल, 40 μg / RNA के एमएल, और Olig के 30 μg / ml से मेल खाता है। परीक्षण के बाद शोषक उपरोक्त गुणांक द्वारा इसी नमूना एकाग्रता प्राप्त करने के लिए परिवर्तित किया जाता है। परीक्षण से पहले, सही प्रक्रिया का चयन करें, स्टॉक समाधान और मंदक की मात्रा दर्ज करें, और फिर रिक्त और नमूना समाधान का परीक्षण करें। हालांकि, प्रयोग हमेशा सुचारू नहीं था। एक्सपर्ट के लिए अस्थिर रीडिंग सबसे बड़ा सिरदर्द हो सकता है। उच्च संवेदनशीलता वाले उपकरण शोष में अधिक बहाव दिखाते हैं।

वास्तव में, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के डिजाइन सिद्धांत और कार्य सिद्धांत एक निश्चित सीमा के भीतर अवशोषण को अलग करने की अनुमति देते हैं, अर्थात, साधन में कुछ सटीकता और सटीकता है। उदाहरण के लिए, Eppendorf Biophotometer की सटीकता of1.0% (1A) है। इस तरह के कई परीक्षणों के परिणाम औसतन लगभग 1.0% के बीच भिन्न होते हैं और सामान्य होते हैं। इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड के भौतिक रासायनिक गुणों और बफर के पीएच जिसमें न्यूक्लिक एसिड को भंग कर दिया जाता है, आयन एकाग्रता, आदि पर विचार करना आवश्यक है। जब परीक्षण के दौरान आयन एकाग्रता बहुत अधिक होती है, तो रीडिंग शिफ्ट, इसलिए एक निश्चित पीएच मान और कम आयन एकाग्रता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। टीई जैसे बफ़र्स, रीडिंग को बहुत स्थिर करते हैं। नमूने की कमजोरता एकाग्रता भी एक कारक है जिसे नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है: नमूने में कुछ ठीक कणों, विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के नमूनों की अपरिहार्य उपस्थिति के कारण। इन छोटे कणों की उपस्थिति परीक्षण के परिणामों में हस्तक्षेप करती है। परीक्षण के परिणामों पर कणों के प्रभाव को कम करने के लिए, न्यूक्लिक एसिड के अवशोषण को कम से कम 0.1 ए से अधिक होना आवश्यक है, और अवशोषक अधिमानतः 0.1 और 1.5 ए के बीच है। इस सीमा के भीतर, हस्तक्षेप। कण अपेक्षाकृत छोटे होते हैं और परिणाम स्थिर होता है।

इसका मतलब है कि नमूने की एकाग्रता बहुत कम या बहुत अधिक नहीं होनी चाहिए (फोटोमीटर की परीक्षण सीमा से परे)। अंत में, ऑपरेटिंग कारक, जैसे कि मिश्रण पर्याप्त होना चाहिए, अन्यथा अवशोषण मूल्य बहुत कम है, यहां तक कि नकारात्मक मूल्य भी; मिश्रण बुलबुले मौजूद नहीं हो सकता है, खाली तरल में कोई निलंबित मामला नहीं है, अन्यथा रीडिंग तेजी से बहती है; रिक्त और नमूने का परीक्षण करने के लिए एक ही क्यूवेट का उपयोग किया जाना चाहिए अन्यथा, एकाग्रता में अंतर बहुत बड़ा है; रूपांतरण कारक और नमूना एकाग्रता इकाई का चयन लगातार किया जाता है; खिड़की पहनने के साथ क्युवेट का उपयोग नहीं किया जा सकता है; नमूने की मात्रा क्युवेट द्वारा आवश्यक न्यूनतम मात्रा तक पहुंचनी चाहिए।

न्यूक्लिक एसिड सांद्रता के अलावा, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर भी नमूने की शुद्धता को इंगित करने वाले कई बहुत महत्वपूर्ण अनुपात दिखाता है, जैसे कि ए 260 / ए 280 का अनुपात, नमूने की शुद्धता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि प्रोटीन का अवशोषण शिखर है 280 एनएम। 1.8 (डीएनए) या 2.0 (आरएनए) के अनुपात से अधिक के साथ एक शुद्ध नमूना। यदि अनुपात 1.8 या 2.0 से कम है, तो यह प्रोटीन या फेनोलिक पदार्थों की उपस्थिति को इंगित करता है। 230 इंगित करता है कि कुछ संदूषक नमूने में मौजूद हैं, जैसे कि कार्बोहाइड्रेट, पेप्टाइड्स, फिनोल आदि, और शुद्ध न्यूक्लिक एसिड ए 230 / ए 230 का अनुपात 2.0 से अधिक है। एक 320 समाधान की मैलापन और अन्य हस्तक्षेप कारकों का पता लगाता है। शुद्ध नमूनों के लिए, ए 320 आमतौर पर 0 है।

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