स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के सामान्य घटकों के सिद्धांत और अनुप्रयोग का परिचय

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का व्यापक रूप से जैविक, रासायनिक, नैदानिक ​​और पर्यावरणीय अनुसंधान में उपयोग किया जाता है।
स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री मापती है कि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक नमूने के माध्यम से प्रकाश की किरण को पारित करके एक रसायन कितना प्रकाश अवशोषित कर सकता है।
पता चला प्रकाश की तीव्रता को मापने के लिए, विधि का उपयोग नमूने में घुला हुआ पदार्थ की एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री की अवधारणा
सैंपल को भेजे गए बीम में फोटॉन बीम होता है।
जब फोटॉन नमूने में अणुओं से मिलते हैं, तो अणु उनमें से कुछ को अवशोषित कर सकते हैं, बीम में फोटॉन की संख्या को कम कर सकते हैं और पता लगाने के संकेत की तीव्रता को कम कर सकते हैं।
संप्रेषण नमूना के माध्यम से गुजरने वाले प्रकाश का हिस्सा है। यह घटना प्रकाश की तीव्रता पर नमूने के माध्यम से गुजरने वाली प्रकाश की तीव्रता के रूप में परिभाषित किया गया है।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापी गई राशि के अनुसार, संप्रेषण, संप्रेषण के विपरीत होता है।
शोषकता के अनुसार, समाधान के नमूने की एकाग्रता बिल लैम्बर्ट कानून से निर्धारित की जा सकती है, जिससे पता चलता है कि अवशोषण और नमूना एकाग्रता के बीच एक रैखिक संबंध है। बीयर लैंबर्ट कानून के अनुसार, अवशोषण अवशोषण गुणांक का उत्पाद है, जो किसी दिए गए तरंग दैर्ध्य पर विलेय द्वारा अवशोषित प्रकाश की मात्रा का माप है और वह दूरी जिससे प्रकाश गुजरता है। नमूना, या यात्रा दूरी, और घनीभूत एकाग्रता। सामान्य तौर पर, अवशोषक को मापने का उद्देश्य नमूने की एकाग्रता को मापना है।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के घटक
प्रत्येक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक प्रकाश स्रोत, एक कोलिमेटर (लेंस या मजबूत और सीधे बीम को संचारित करने के लिए एक ध्यान केंद्रित करने वाला उपकरण) होता है, जो विभिन्न तरंग दैर्ध्य के बीमों को अलग करने के लिए एक मोनोक्रोमेटर और वांछित तरंग दैर्ध्य की तरंग और खांचे का चयन करने के लिए एक लंबाई चयनकर्ता होता है। इस वीडियो में प्रस्तुत स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में प्रयुक्त प्रकाश की तरंग दैर्ध्य पराबैंगनी और दृश्यमान प्रकाश की सीमा में है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक नमूना धारक, एक फोटोडेटेक्टर और एक स्क्रीन शामिल है जो डिटेक्टर के परिणामों को प्रदर्शित करता है।
सबसे हालिया स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को सीधे कंप्यूटर से जोड़ा जाता है, जहां प्रयोगात्मक मापदंडों को नियंत्रित किया जा सकता है और परिणाम प्रदर्शित किए जा सकते हैं।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का कार्य सिद्धांत
स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री करते समय, उचित सावधानी बरतना महत्वपूर्ण है, जैसे दस्ताने पहनना, आपके द्वारा उपयोग किए जाने वाले जैविक या रासायनिक समाधान के आधार पर।
डिवाइस को चालू करें और नमूने के यूवी-विज़ स्पेक्ट्रम को मापने से पहले दीपक और इलेक्ट्रॉनिक्स को गर्म करने की अनुमति दें।
एक ही पीएच और समान आयनिक ताकत के साथ एक ही समाधान का एक खाली नमूना तैयार करें, लेकिन विश्लेषण किए जाने वाले घटकों के बिना; चूंकि क्युवेट और विलायक प्रकाश को फैला सकते हैं, इसलिए नमूने का विश्लेषण करना आवश्यक है।
पारंपरिक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नमूना धारक को प्लास्टिक और क्वार्ट्ज कटोरे रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक कटोरे में मूल समाधान पिपेट करें।
किसी भी उँगलियों के पोरों को पोंछने और कटोरे के बाहर की तरफ छींटे डालने के बाद, नमूने धारक में क्युवेट सही ढंग से डालें और ढक्कन का दरवाजा बंद कर दें।
दरवाजा बंद करना कभी न भूलें क्योंकि एक खुले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से यूवी विकिरण आपकी आंखों और त्वचा को नुकसान पहुंचा सकता है।
वांछित तरंग दैर्ध्य या तरंग दैर्ध्य रेंज का कार्यक्रम करें जो नमूना को प्रेषित किया जाएगा। यह सबसे अच्छा तरंग दैर्ध्य पर निर्भर करता है जिसका विश्लेषण किया जा रहा घटक अवशोषित कर सकता है। मशीन को तब खाली नमूने को मापने के द्वारा शून्य किया जाता है, जो नमूना बफर के कारण नीचे के अवशोषण को घटाता है।
स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री प्रयोग के प्रकार के आधार पर, आप नमूना माप से पहले एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकते हैं, जिसमें से नमूना में विश्लेषण किए गए यौगिक की एकाग्रता निर्धारित की जा सकती है।
नमूने को उचित तापमान तक पहुंचने दें और बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए धीरे से मिलाएं। फिर नमूना को मशीन के अंदर सीधे कटोरे में जोड़ा जा सकता है और एक रीडिंग बनाई जा सकती है।
अवशोषण के लिए नमूना को मापने के बाद, प्रयोग की सही गणना की जाती है; उदाहरण के लिए, एकाग्रता या एंजाइम गतिविधि स्तर निर्धारित करने के लिए।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का अनुप्रयोग
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के सामान्य उपयोगों में से एक सेल घनत्व को मापना है। सेल घनत्व माप का उपयोग बैक्टीरिया के लॉगरिदमिक विकास वक्र का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें से पुनः संयोजक प्रोटीन के एकीकरण के लिए इष्टतम समय निर्धारित किया जा सकता है।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग रासायनिक प्रतिक्रिया दर को मापने के लिए भी किया जा सकता है। इस अवतार में, एंजाइमैटिक एंजाइम प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए उपयोग किया जाता है, जो 452nm की मध्यवर्ती प्रतिक्रिया के माध्यम से समय के साथ गायब हो जाता है। इस एंजाइमैटिक स्टेप की दर की गणना उचित समीकरण के साथ डेटा का मिलान करके की जा सकती है।
माइक्रो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की शुरूआत नमूना धारक की आवश्यकता को समाप्त करती है। ये स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नमूना बनाए रखने के लिए सतह तनाव का उपयोग करते हैं।
प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित, छोटे और महंगे नमूनों के द्रव्यमान और एकाग्रता को मापने के लिए माइक्रोस्पेक्ट्रोफोटोमीटर सबसे अच्छा विकल्प है।
280nm पर प्रोटीन का अवशोषण ट्रिप्टोफैन, टायरोसिन और फेनिलएलनिन में पाए जाने वाले सुगंधित पक्ष श्रृंखलाओं की सामग्री पर निर्भर करता है, साथ ही दो सिस्टीन के बीच डाइसल्फ़ाइड बांड भी।
प्रोटीन की एकाग्रता 280nm पर इसके अवशोषण और इसके अवशोषण गुणांक द्वारा निर्धारित की जा सकती है, जो अमीनो एसिड की संरचना पर आधारित है।
डीएनए और आरएनए में 260nm पर अधिकतम अवशोषण होता है, जिससे उनकी सांद्रता निर्धारित की जा सकती है। न्यूक्लिक एसिड की शुद्धता का मूल्यांकन अब्सॉर्बेंस रीडिंग के अनुपात से विशिष्ट तरंग दैर्ध्य तक भी किया जा सकता है।