स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में न्यूक्लिक एसिड का मात्रा
न्यूक्लिक एसिड की मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला कार्य है । Oligonucleotides, एकल फंसे, डबल फंसे डीएनए, और आरएनए बफर में मात्राबद्ध किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड के उच्चतम अवशोषण शिखर का अवशोषण शिखर 260 एनएम है। प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड में एक अलग आणविक संरचना होती है और इसलिए विभिन्न रूपांतरण कारक होते हैं। विभिन्न प्रकार के न्यूक्लिक एसिड को मापने के लिए, पहले से संबंधित गुणांक का चयन करें। उदाहरण के लिए, 1OD का अवशोषण 50 μg / मिली डीएसडीएनए, 37 माइक्रोग्राम / एमएल एसएसडीएनए, 40 माइक्रोग्राम / एमएल आरएनए, और 30 μg / मिलीलीटर ओलिग के बराबर है। परीक्षण के बाद अवशोषण मूल्य उपरोक्त गुणांक द्वारा इसी नमूना एकाग्रता प्राप्त करने के लिए परिवर्तित किया जाता है। परीक्षण से पहले, सही प्रक्रिया का चयन करें, स्टॉक समाधान की मात्रा दर्ज करें और diluent, और रिक्त और नमूना समाधान का परीक्षण करें। हालांकि, प्रयोग आसान नहीं था। अस्थिर रीडिंग प्रयोगकर्ताओं के लिए सबसे बड़ा सिरदर्द हो सकता है। उपकरण की संवेदनशीलता जितनी अधिक होगी, उतनी ही अधिक प्रदर्शित अवशोषण बहाव।
वास्तव में, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का डिज़ाइन सिद्धांत और कार्य सिद्धांत अवशोषण मूल्य को एक निश्चित सीमा के भीतर बदलने की अनुमति देता है, यानी, उपकरण की सटीकता और सटीकता की एक निश्चित डिग्री होती है। जैसे एपेंन्डोर्फ़ बायोफोटोमीटर सटीकता ≤ 1.0% (1 ए)। इन एकाधिक परीक्षणों के परिणाम 1.0% के बीच भिन्न होते हैं और सभी सामान्य होते हैं। इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड के भौतिक रसायन गुण, न्यूक्लिक एसिड, आयन एकाग्रता इत्यादि को भंग करने के लिए बफर के पीएच को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए: परीक्षण के दौरान, आयन एकाग्रता बहुत अधिक होती है जिससे पढ़ने के कारण भी टीई के रूप में बहाव, जो पढ़ने को काफी स्थिर करेगा। नमूना की पतला सांद्रता भी एक गैर-नगण्य कारक है: नमूने में छोटे कणों की अनिवार्य उपस्थिति के कारण, विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड नमूने। इन छोटे कणों की उपस्थिति परीक्षण प्रभाव में हस्तक्षेप करती है। परीक्षण परिणामों पर कणों के प्रभाव को कम करने के लिए, न्यूक्लिक एसिड का अवशोषण कम से कम 0.1 ए होना आवश्यक है, और अवशोषण अधिमानतः 0.1-1.5 ए है। इस सीमा में, इसमें कोई बुलबुले नहीं होना चाहिए मिश्रण, और खाली में कोई निलंबन नहीं है। अन्यथा, रीडिंग हिंसक रूप से बहाव; रिक्त और नमूना का परीक्षण करने के लिए एक ही रंगमेट्रिक कप का उपयोग किया जाना चाहिए; अन्यथा, एकाग्रता अंतर बहुत बड़ा है; रूपांतरण गुणांक और नमूना एकाग्रता इकाई समान हैं; खिड़की से पहने हुए क्यूवेट; नमूना की मात्रा रंगीन कप की आवश्यक न्यूनतम मात्रा से अधिक तक पहुंचनी चाहिए।
न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता के अलावा, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नमूना की शुद्धता का आकलन करने के उद्देश्य से नमूना की शुद्धता को इंगित करने के लिए एक साथ कई महत्वपूर्ण अनुपात दिखाता है, क्योंकि प्रोटीन की अवशोषण चोटी के बाद से नमूना की शुद्धता का आकलन करने के उद्देश्य से ए 260 / ए 280 अनुपात 280 एनएम है शुद्ध नमूने में 1.8 (डीएनए) या 2.0 (आरएनए) से अधिक अनुपात होता है। यदि अनुपात 1.8 या 2.0 से कम है, तो यह प्रोटीन या फेनोलिक पदार्थों की उपस्थिति को इंगित करता है। ए 230 इंगित करता है कि नमूने में कार्बोहाइड्रेट, पेप्टाइड्स, फिनोल इत्यादि जैसे नमूने में कुछ प्रदूषक हैं। शुद्ध न्यूक्लिक एसिड ए 260 / ए 230 का अनुपात 2.0 से अधिक है। ए 32020 समाधान और अन्य हस्तक्षेप कारकों की अशांति का पता लगाता है। शुद्ध नमूना, ए 320 आमतौर पर 0 है।
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